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Transnetyx說明書
產品時間:2022-08-25
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通過 DNGR-1 表達歷史進行遺傳追蹤將樹突狀細胞定義為造血譜系

作者鏈接打開覆蓋面板芭芭拉·U·施拉姆1詹內克··布里斯韋克1圣地亞哥澤萊奈1保羅·惠特尼1安德魯·菲爾比2蘇菲·E·阿克頓13尼爾·C ·羅杰斯1娜塔莉亞·蒙考特4海梅·J·卡瓦哈爾45卡埃塔諾·雷斯·索薩1

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被引用

Carmen GerlachAude ThiriotUlrich H. von Andrian

起源和譜系:樹突狀細胞的譜系追蹤

單元格,第 154 卷,第 4 期,2013 8 15 日,第 720-722

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強調

•DNGR-1 標記 DC 前體

追蹤 DNGR-1 表達歷史定義了常規 DC

分析揭示了非淋巴組織中以前未被重視的 DC 群體

•DC的個體發育定義有助于闡明單核吞噬細胞功能

 

概括

基于細胞形態、表型或選擇的功能特性,單核吞噬細胞被分類為巨噬細胞或樹突狀細胞 (DC)。然而,這些屬性不是絕對的并且經常重疊,導致細胞類型識別困難。為了規避這個問題,我們描述了一個小鼠模型,以根據它們從承諾前體的個體遺傳后代來定義 DC。我們表明,小鼠常規 DC 的前體,而不是其他白細胞,以 DNGR-1 的表達為標志。DNGR-1 表達歷史的遺傳追蹤特別標記了傳統上歸屬于DC 譜系的細胞,并且這種限制在炎癥后保持不變。值得注意的是,在某些組織中,以前被認為是單核細胞/巨噬細胞的細胞實際上是 DC 前體的后代。這些研究為 DCs 的命運圖譜提供了體內模型,將它們與其他白細胞譜系區分開來,從而有助于揭示單核吞噬細胞系統的功能復雜性。

 

圖形概要

 

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介紹

樹突狀細胞 (DC) 在免疫調節中起關鍵作用。從以前看,DC 已被鑒定為具有樹突形態的非淋巴細胞運動細胞,表達高水平的主要組織相容性復合物II 類分子 (MHCII) 和整合素CD11c ( Geissmann 等人,2010Hashimoto 等人,2011Heath Carbone 2009 年,斯坦曼和伊多亞加,2010 年)。此外,功能標準,包括遷移能力和刺激T 淋巴細胞的能力,通常用于區分 DC 與其他單核吞噬細胞例如巨噬細胞 (M?s) 和單核細胞( Hashimoto et al., 2011,Milling et al., 2010,Steinman and Idoyaga, 2010)。然而,功能屬性不是離散的細胞特性,表型標記通常在相關細胞類型之間共享,特別是在感染后或炎癥期間,當它們上調和下調時。無法準確區分 DCs M?s 導致了混亂和爭論,并且難以評估單個單核吞噬細胞亞型是否在免疫系統中具有的功能(Hashimoto 等人,2011 年,Hume2008 年)。

 

基因表達分析和個體發生關系已被用于細化 DCs M?s 的定義。例如,通過比較基因表達特征和/或證明給定種群的發展取決于特定的轉錄因子、細胞因子、或生長因子(Gautier 等人,2012 年, Geissmann 等人,2010 年, Greter 等人,2012 年, Haniffa 等人,2012 年, Hashimoto 等人,2011 年, Heath Carbone2009 年, Hildner 等人, 2008 年,梅雷迪思等人,2012a年,Miller et al., 2012 , Persson et al., 2013 , Satpathy et al., 2012 , Satpathy et al., 2011 , Schlitzer et al., 2013 , Schulz et al., 2012 , Tussiwand et al., 2012 )。盡管如此,仍然需要統一 DC 家族并將其確立為獨立的白細胞譜系的總體個體遺傳學定義(Hashimoto 等人,2011 年)。

 

缺乏譜系限制標記 (lin) 并表達 CD115M-CSF 受體)、 CD135  CX 3 CR1 和低水平CD117c-kit )的小鼠骨髓 (BM) 細胞, 干細胞因子受體) 在體外培養或轉移到小鼠體內后僅產生 DC, 被稱為常見 DC 前體 (CDP) ( Auffray et al., 2009 , Liu et al., 2009 , Naik et al., 2007 , Onai 等人,2007 年)。CDP 不會離開 BM,但會產生前 DC,它們通過血液遷移到淋巴和非淋巴器官,在那里它們最終分化為常規 DC (cDC),包括兩個主要的 CD11b + CD11b– cDC 子集(Ginhoux 等人,2009 年,Liu 等人,2009 年,Naik 等人,2006 年,Naik 等人,2007 年,Onai 等人,2007 年)。相比之下,漿細胞樣 DCs (pDCs) 被認為是獨立于前 DCs 衍生自 CDPs ( Liu et al., 2009 , Naik et al., 2007 , Onai et al., 2007 ),盡管它們的 CDP 起源最近受到質疑(Onai 等人,2013 年)。

 

由于個體發育是不可變的,CDP 和前 DC 后代的跟蹤應允許定義DC 譜系,而不管標記或功能標準如何。這將有助于解決單核吞噬細胞家族內的命名問題,并為研究穩態和炎癥或感染后的 DC 動力學提供系統。在這里,我們報告可以通過 C 型凝集素受體 DNGR-1 的表達在小鼠中定義 cDC 的前體,并描述了表達 DNGR-1 的細胞及其后代的遺傳標記模型,該模型允許對 DC 進行個體遺傳學定義小鼠的血統。

 

結果

DNGR-1 標記 CDP Pre-DC

DNGR-1(也稱為 CLEC9A)在小鼠中由 CD8α + CD103 + CD11b - cDCs 高水平表達,而 pDCs 在較低水平表達(Caminschi 等人,2008 年,Poulin 等人,2012 年,Sancho 等人。 , 2008 年)。我們還注意到脾前 DCs 上存在低水平的受體,定義為lin - CD11c + CD43 + CD135 + CD172a低細胞 ( Naik et al., 2006 ),來自野生型,但不是對照 DNGR-1 -缺陷( Clec9a gfp/gfp ) 小鼠 ( Sancho et al., 2009 ; S1 A 可在線獲取)。來自 BM 的前 DCs 也表達 DNGR-1(圖 S1 B)。在該器官中,在 lin - CD11c - CD115 +隔室中還發現了DNGR-1 +細胞,其中包括 M?/DC 前體(MDPFogg 等人,2006)和 CDP(圖1A)。然而,DNGR-1 表達與較低水平的CD117相關(圖1A),這是一種在轉移研究中與 CDP 活性相關的表型(Auffray 等人,2009 年,Naik 等人,2007 年,Onai 等人,2007 年)。事實上,我們發現 CD117 上的單峰 DNGR-1 表達低,但不在 CD117 hi細胞或來自對照Clec9a gfp/gfp BM CD117 low細胞上( Sancho 等人,2009)(圖1A S1C)。lin - CD11c - DNGR-1 +細胞另外表達 CD135,但不表達 CD127 (IL-7Rα),這是淋巴前體的標志物 ( Schlenner 等人,2010 )(數據未顯示),因此表型類似于 CDP

 

 

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S1DNGR-1 專門標記 DC 前體和 DNGR-1 +前體細胞的排序策略和排序后分析,與圖 1相關

 

(A) WT Clec9a gfp/gfp小鼠的脾單細胞懸液進行譜系 (lin) 標記(Ter119NK1.1CD4CD8B220CD11bMHCII)、CD11cCD43CD172a DNGR-1 染色并通過流式細胞儀進行分析。脾前 DC 被鑒定為 lin - CD43 + CD135 + CD172a低細胞。直方圖疊加顯示來自 WT(紅線)和Clec9a gfp/gfp小鼠(黑線)的脾前 DCs 上的 DNGR-1 染色。

 

(B C) 對來自 WT Clec9a gfp/gfp小鼠的BM 單細胞懸液進行譜系標記、CD11cCD117CD115 DNGR-1 染色,并通過流式細胞術進行分析。(B) BM 中的前 DC 被鑒定為 lin - CD11c + CD135 +細胞并分析 DNGR-1 表達。與 BM DCs 相比,脾臟上明顯較低的受體表達可能是由于在用于分離脾細胞的消化過程中 DNGR-1 的切割造成的偽影(JvBBUS CRS,未發表的數據)。(C) 1 A中確定的 MDP CDP DNGR-1 +細胞的百分比 ( Auffray et al., 2009 , Fogg et al., 2006, Onai et al., 2007 ) 顯示。每個符號代表一只鼠標,水平條代表平均百分比。

 

(D) 分選策略:使用磁珠富集BM lin -細胞(Ter119NK1.1CD4CD8B220MHCIICD11b CD11c),并對 CD115CD117 DNGR-1 進行染色。Lin - CD115 + DNGR-1 +細胞被分選。DNGR-1 +門通過用同種型匹配的對照抗體染色來定義(右中圖)。數字表示每個門中細胞的百分比;箭頭表示門控策略。

 

 

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1DNGR-1 標記具有 cDC 受限分化潛能的細胞

 

(A) Lin - (Ter119NK1.1CD4CD8B220CD11b MHCII)CD11c -來自 WT BM 細胞和Clec9a gfp/gfp小鼠通過流動分析 CD117CD115 DNGR-1細胞術。上圖: lin - CD11c - CD115 +細胞上的 DNGR-1 CD117 表達。底部: lin - CD11c - CD115 + MDPCD117 hi CD135 +)和 CDPCD117CD135 +)上的 DNGR-1 表達。

 

B C)將來自 CD45.1 B6.SJL 小鼠的 Lin - CD115 + DNGR-1 +細胞(lin - DNGR-1 +)或總 BM 轉移到未照射的 CD45.2 受體中。在第 7 天,分析了 CD45.1 +供體來源的脾細胞的譜系標記 (B) 的表達。(C) 分析 CD45.1 + CD11c + MHCII + cDC CD205 CD11b 以識別 CD205 + CD11b - DC CD11b + CD205 - DCCD11cMHCII - CD45.1 +分析細胞的譜系標記。數據代表三個實驗,每組有兩到三只小鼠。

 

(D E) CD45.1 + lin - CD115 + DNGR-1 + (lin - DNGR-1 + , n = 5) 或總 BM (n = 6) 細胞被轉移到亞致死照射的 CD45.2 受體中。在第 7 天,分析脾 CD45.1 +細胞的 CD11c MHCII (D) CD11c SiglecH (E) 表達。

 

參見圖 S1

 

為了確定 DNGR-1 標記具有 DC 限制潛力的祖細胞,我們從 CD45.1 B6.SJL 小鼠的 BM中分選了 lin - CD115 + DNGR-1 +細胞,無論 CD117 水平如何(圖 S1 D;稱為 lin - DNGR-1 +細胞)并將它們轉移到未照射的 CD45.2同類宿主中。對照(未分級)BM 產生多種淋巴和骨髓譜系,包括 B (B220 + MHCII + )T (CD3 + ) NK (NK1.1 + CD3 - ) 細胞、中性粒細胞/單核細胞 (Gr-1 + CD11b + ) cDCs (CD11c +MHCII + ) ( 1B 1C)。相比之下,lin - DNGR-1 +細胞幾乎只產生 CD11c + MHCII + cDC,包括 CD11b -(也稱為 CD8α +,在此通過 CD205 表達確定)和 CD11b +亞群以預期的比率(圖 1 B 1C ; 數據未顯示)。

 

lin - DNGR-1 +細胞的后包括 CD11cMHCII -細胞。這些細胞缺乏 pDC 標記 Gr-1B220 SiglecH,與 CD11cMHCII -源自總 BM 的細胞相反(圖 1 C),但表達低水平的 F4/80 CD11b(圖 1 C),表明它們可能構成前 DCNaik 等人,2006 年)。與該概念一致,lin - DNGR-1 + BM 細胞僅產生 CD11c + MHCII + 轉移到亞致死照射宿主后的 cDC,其中增加的生態位有利于供體細胞的終末分化(圖1D)。相比之下,對照總 BM 產生了多種細胞類型,包括 pDC(圖1D 1E)。因此,在過繼轉移中,lin - DNGR-1 +細胞特異性地產生 cDC,但不產生 pDC 或其他淋巴或骨髓細胞,這表明 DNGR-1 標志著 cDC 限制性前體。我們繼續將 DNGR-1 + CD11c -前體稱為“CDP",盡管我們的數據表明該首字母縮寫詞更好地擴展為常規 DC 前體"(見討論)。

 

Clec9a -Cre 小鼠允許在 BM 中進行 CDP 的遺傳標記及其在淋巴組織中的后代

我們假設追蹤 DNGR-1 的表達歷史將使我們能夠確定 CDP 和前 DCs 對單核吞噬細胞系統的個體發育貢獻。我們通過同源重組產生了在Clec9a基因座控制下表達Cre 重組酶的小鼠(圖 S2 A S2B),并將它們與 Rosa26-stop flox增強型黃色熒光蛋白(YFP)報告小鼠雜交(Srinivas 等人,2001)(以下簡稱稱為Clec9a +/+ Rosa +/EYFPClec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠,表明兩個基因座的基因型)。在Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠中,預計 Cre 介導的floxed終止密碼子切除會導致 YFP 的組成型表達,從而不可逆地標記表達 DNGR-1 的細胞及其后代。

 

 

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S2。生成Clec9a -Cre 小鼠和門控策略以識別免疫細胞,與圖 2相關

 

(A) 顯示了內源基因組Clec9a基因座、靶向構建體和突變等位基因。用BamHI對基因組基因座進行限制性酶切會產生 13kb 野生型片段,該片段可被 5' Southern Blot探針檢測到。在目標等位基因中,5' 探針檢測到一個 9.3kb 片段。使用跨越 3' 同源臂并產生 2.2kb PCR 產物的 PCR 篩選ES 細胞克隆的靶向性。

 

(B) ES 細胞中靶向Clec9a等位基因的 Southern Blot 分析。5' 探針用于雜交來自對照和靶向 ES 細胞的 BamHI 消化的基因組 DNA

 

(C) 用于識別淋巴 (C) 和骨髓 (D) 細胞譜系的門控策略。(C) 對來自Clec9a +/cre Rosa +/EYFP的脾消化物的單細胞懸浮液進行染色,以獲得所示的細胞表面標志物。繪圖在活細胞(Dapi 陰性)上預先設門,具有白細胞散射分布和低自發熒光(以排除紅髓 M?)。顯示了 T 細胞 (CD3 + NK1.1 - )NKT 細胞(CD3 + NK1.1 + )NK 細胞 (NK1.1 + CD3 - ) B 細胞 (CD19 + CD3 - )上的 YFP 表達。

 

(D) 分析了具有白細胞散布的活細胞的表面標志物的表達。紅髓 M?s 被鑒定為 F4/80 hi自發熒光細胞。在剩余的細胞部分中, Ly-6G + CD11b +陽性細胞被鑒定為嗜中性粒細胞。在剩余部分中,CD11b + Gr-1 hi細胞被鑒定為 Ly-6C hi單核細胞,具有高 SSC 和低 FSC 譜的Gr-1低細胞被鑒定為嗜酸性粒細胞。(C, D) 用于識別 YFP 陽性細胞的門設置在Clec9a +/+ Rosa +/EYFP對照小鼠(未顯示)。

 

我們首先驗證了Clec9a驅動的 Cre DC 前體中是活躍的。實際上,在 CDP 和前 DC 中檢測到 YFP,但在Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠的 MDP 中未檢測到,如表型所定義(圖2A -2C)。然而,只有一小部分 DC 前體被標記,表明在群體水平上終止密碼子的重組是不完整的(見下文)。盡管如此,我們在Clec9a +/cre Rosa +/EYFP的脾臟中發現了 YFP +細胞 ,但沒有發現 Clec9a +/+ Rosa +/EYFP小鼠(圖 2 D-2F)。大多數 YFP +脾細胞 是 CD11c + MHCII + cDCs (86.9% ± 4%),而一小部分 (1.7% ± 0.4%) 類似于 F4/80 hi自發熒光紅髓 M?s。其余的是 CD11cMHCII/-并且包括表達 SiglecHB220 Gr-1 的細胞,但不包括類似于 pDC CD11b(圖2D 2E)。YFP 信號是細胞自主的,不是由旁觀者攝取 YFP +細胞或細胞碎片引起的,這是通過使用混合 BM 嵌合體確定的(圖 2 G)。圖像分析進一步支持了這一點,顯示 YFP 的均勻細胞溶質而不是內體定位(圖2H)。YFP +的系統分析脾細胞顯示 BTNK NKT 細胞、中性粒細胞或 Ly-6C hi單核細胞的貢獻最小(圖 2 FS2 C S2D)。沒有觀察到紅細胞或非造血細胞的 YFP 標記(數據未顯示)。

 

 

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2Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠表現出 DC 限制性 YFP 表達

 

A-C)來自Clec9a +/+ Rosa +/EYFPClec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠的 BM 流式細胞術。顯示了 lin - CD11c - CD115 +細胞 (A) 和前 DCs (lin - CD11c + CD135 +,平均百分比 ± SDn = 6) (B) 上的 YFP 表達。YFP +門設置在來自Clec9a +/+ Rosa +/EYFP對照小鼠的細胞上(未顯示)。(C) MDP YFP +細胞的百分比 (lin - CD11c - CD115 + CD135 +Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠的CD117 hi )CDPs (lin ? CD11c ? CD115 + CD135 + CD117 low,參見圖 1 A) pre-DCs (lin ? CD11c + CD135 + )

 

(D-F) Clec9a +/cre Rosa +/EYFPClec9a +/+ Rosa +/EYFP小鼠脾臟的流式細胞術分析。(D) 鑒定并分析活 YFP +細胞是否存在 F4/80 hi自發熒光(自動)紅髓 M? CD11c + MHCII + cDC(E) 進一步分析 (D) 中鑒定的 YFP + CD11cMHCII/-細胞的 Gr-1SiglecH B220(F) YFP +細胞中種群的百分比。(C F)水平條是至少兩次實驗的平均值。

 

(G H) CD45.1 + B6.SJL CD45.2 + Clec9a +/cre Rosa +/EYFP BM 1:1 混合物靜脈注射致死性輻照小鼠。6-8 周后分析CD11b + CD8α + CD205 + CD11c + MHCII + cDC 的供體 BM 貢獻和 YFP 表達。(H) Image Stream 中的代表性圖像,顯示 CD11c + CD11b + CD11c + CD11b中的 YFP 信號-來自Clec9a +/cre Rosa +/EYFP的脾 DC老鼠。明場圖像顯示樹突狀細胞形態(放大 60 倍)。

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