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Phoreusbiotech支鏈兩親性肽膠囊在昆蟲飼料中傳遞致死性 dsRNA 的研究。

Avilaa，b，，1，R. Chandrasekarb，1，K.E.巴爾薩佐布，c，M。希爾曼布，J。貝查德布，S。布朗德，Y.Parke，S.Dharf，G.R。Reeckb J.M.托米克巴生物科學(xué)系，奧本大學(xué)，奧本，AL 36849，美國阿布生物化學(xué) & 分子生物物理學(xué)，堪薩斯州立大學(xué)，KS 66506-3902，美國化學(xué)系，富特海斯州立大學(xué)，KS 67601-4099,美國生物學(xué)部，堪薩斯州立大學(xué)，KS 66506-3902，美國昆蟲學(xué)系，堪薩斯州立大學(xué)，KS 66506-4004，美國物理系，奧本大學(xué)，奧本，AL 36849，美國

開發(fā)新的和特定的害蟲管理方法對(duì)于克服殺蟲劑抗性和附帶的非目標(biāo)害是至關(guān)重要的。通過向昆蟲提供 dsRNA 來實(shí)現(xiàn)基因沉默在這一領(lǐng)域顯示了希望。在這里，我們描述了一種多肽納米材料的使用，分支兩親肽膠囊(BAPC) ，促進(jìn)細(xì)胞攝取雙鏈 RNA 的昆蟲通過喂養(yǎng)。昆蟲飼料包括與 BAPC 絡(luò)合的和不與 BAPC 絡(luò)合的 dsRNA。選取的昆蟲品種來自兩個(gè)不同的目，以不同的取食機(jī)制: 赤擬谷盜和碗豆蚜。測(cè)試的基因轉(zhuǎn)錄本(BiP 和 Armet)是未折疊蛋白反應(yīng)的一部分，抑制它們的翻譯會(huì)導(dǎo)致致命性。對(duì)于無芒草屬，與攝入相同量的游離 BiP-dsRNA (t1/2 = 11-12天)相比，攝入與 BAPC 相關(guān)的 BiP-dsRNA 導(dǎo)致蚜蟲過早死亡(t1/2 = 4-5天)。使用 BiP-dsRNA 和與 BAPC 復(fù)合的 Armet-dsRNA 的組合有效地殺死赤擬谷盜; 大多數(shù)在幼蟲或羽化期間死亡(? 75%)。單獨(dú)喂食 dsRNA 導(dǎo)致較少的死亡(約30%)。結(jié)果表明，雙鏈 RNA 與 BAPC 的復(fù)合增強(qiáng)了雙鏈 RNA 的口服遞送。1.前言我們最近描述了一類由支化兩親肽膠囊(BAPCs)制成的新型納米材料[1]。這些納米膠囊具有不尋常但非常理想的特性，可以解決與其他納米顆粒相關(guān)的一些缺點(diǎn)[2]。例如，它們是水溶性的，在血液中穩(wěn)定，*由天然氨基酸制成[3]。它們顯示大小(取決于退火條件) ，范圍從10到50納米，并耐洗滌劑，蛋白酶和混沌[4,5,6]。本研究中使用的 BAPC 由兩種分支肽: 雙(AcFLIVIGSII)-K-K4-CO-NH2和雙(Ac-FLIVI)-K-K4-CO-NH2的等摩爾混合物組成，并且來源于人心臟 L 型二氫吡啶敏感鈣通道的孔形成片段之一[1]。這些納米膠囊有望作為一種替代的非病毒核酸載體，體外和體內(nèi)系統(tǒng)[3]。在體外，DNA-BAPC 納米顆粒已被用于轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞系，包括 HEK, HeLa 和小鼠樹突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率高于普遍使用的基于脂質(zhì)的商業(yè)產(chǎn)品，細(xì)胞毒性可以忽略不計(jì)[3]。在體內(nèi)，BAPC 能夠在小鼠體內(nèi)傳遞編碼 HPV-16(pgDE7) E7癌蛋白的疫苗 DNA。用 pgDE7-BAPC 納米膠囊復(fù)合物免疫的小鼠在腫瘤細(xì)胞移植后一個(gè)月內(nèi)抑制腫瘤生長，沒有明顯的毒性作用[3]。基于兩種不同成像技術(shù)的物理 BAPC/DNA 相互作用的研究揭示了平均大小在50nm3到250nm3之間的致密團(tuán)簇。與 DNA 的組蛋白壓縮形成核小體相比，20-30nm 的 BAPC 與質(zhì)粒 DNA 相互作用，作用于帶負(fù)電荷的 DNA 與外表面結(jié)合的無性成核中心[3]。這些結(jié)果表明，BAPC 促進(jìn)質(zhì)粒 DNA 和其他類型的核酸，如小寡核苷酸或 RNA 的攝取。DsRNA 進(jìn)入細(xì)胞是當(dāng)代分子生物學(xué)中最有用的工具之一的第一步: 通過RNAi [7,8].基于 RNAi 的轉(zhuǎn)錄本敲低已經(jīng)在許多目的昆蟲中使用，并且是昆蟲反向遺傳學(xué)工具箱的關(guān)鍵部分[9]。DsRNA 構(gòu)建體已經(jīng)通過顯微注射到血淋巴中，主要用于昆蟲[10]。雖然有效，但注射也有其局限性，包括治療大量昆蟲的單調(diào)乏味和注射較小的昆蟲種類(或發(fā)育早期)的困難。除了注射，諸如浸泡[11]和攝取的方法已經(jīng)被探索，但成功和重復(fù)性有限。最近，一些研究表明，攝取與納米材料相關(guān)的 dsRNA 可以增強(qiáng)沉默活性[12,13,14]。已經(jīng)觀察到陽性結(jié)果形成 dsRNA 與陽離子脂質(zhì)和修飾的多糖如殼聚糖的復(fù)合物[12]。然而，盡管這種進(jìn)展，RNAi 效應(yīng)是低和高度可變的。該領(lǐng)域的共識(shí)，主要來自不成功的，因此未發(fā)表的研究，是喂養(yǎng)昆蟲的 dsRNA 在好的情況下是低效的，在最壞的情況下是*無效的[8]。在這項(xiàng)研究中，BAPC 被測(cè)試的能力，促進(jìn)攝取 dsRNA 的昆蟲通過喂養(yǎng)，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄敲低。昆蟲飼料包括含有和不含有 BAPC 絡(luò)合物的 dsRNA。選擇的昆蟲種類來自不同的目和不同的取食機(jī)制: 赤擬谷盜(Tribolium castaneum)用改良的固體面粉飼料喂養(yǎng)紅粉甲蟲，豌豆蚜(pea aphid)用人工液體飼料喂養(yǎng)碗豆蚜。這兩種昆蟲的基因組序列已經(jīng)發(fā)表。Tribolium 是一個(gè)主要的遺傳模型，其中通過 dsRNA 注射的轉(zhuǎn)錄敲低可能比任何其他昆蟲物種更有效[17]。此外，它還是一種與人類生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)過程有關(guān)的模式生物[17]。作為這兩個(gè)物種的主要靶標(biāo)，我們選擇了 BiP (GRP78)的轉(zhuǎn)錄本。它的活性在未折疊蛋白應(yīng)答(UPR)中是重要的[18]。對(duì)于 Tribolium，我們包括另一個(gè)普遍定期審議成員 Armet (也稱為 MANF)的轉(zhuǎn)錄本[19]。在 Tribolium 的一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，我們敲除了 Vermillion 轉(zhuǎn)錄本，作為*內(nèi)部器官中的轉(zhuǎn)錄本的例子(與腸道相反，腸道是敲除 BiP 和 Armet 轉(zhuǎn)錄本的可能作用部位)。*編碼的氧化酶，所需的棕色眼睛色素合成在 Tribolium [20]。攝食 BAPC-Vermillion-dsRNA 復(fù)合物導(dǎo)致處理昆蟲眼睛顏色不深。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用 BAPC/dsRNA 復(fù)合物處理后，熒光標(biāo)記的 dsRNA 定位于解剖的成年 Tribolium 的內(nèi)臟。RNAi 技術(shù)在消除病蟲害方面具有巨大的潛力，但需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來確定可獲得的細(xì)胞靶標(biāo)中的合適的基因靶標(biāo)，使用的方法可以很容易地縮放。本報(bào)告中描述的生物膠囊促進(jìn)了在體內(nèi)口服遞送具有高效率和低細(xì)胞毒性的 dsRNA (納米膠囊單獨(dú)使用)的系統(tǒng)。形成膠囊的自組裝肽容易以高純度合成，在純水中組裝，并且可以在存在 dsDNA 或 dsRNA 的情況下在復(fù)水之前長時(shí)間儲(chǔ)存。這些肽的合成很容易被縮放到多重水平，并且每次處理所需的 μM 濃度較低，使用這些載體的成本應(yīng)該使得任何研究人員都可以使用這種工具來在高價(jià)值的情況下控制害蟲。

材料及方法2.1。多肽合成如前所述合成并切割支化的兩親肽雙(Ac-FLIVIGSII)-K-K4-CO-NH2和雙(Ac-FLIVI)-K-K4-CO-NH2[1]。切割后的肽用二洗滌三次，溶于水中，凍干后放入室溫下保存。反相高效液相色譜純化多肽，基質(zhì)輔助激光解吸/電離時(shí)間飛行(MALDI TOF/TOF)進(jìn)行表征。雙(Ac-FLIVIGSII)-K-K4-CO-NH2和雙(Ac-FLIVI)-KK4-CO-NH2分別溶于純2,2,2-三氟乙醇(TFE)中，并以等摩爾比混合在一起，最終濃度為1mM。使用在257.5 nm (195cm-1M-1)水中的摩爾吸收率(ε)計(jì)算肽濃度。混合后，他們?cè)试S停留10分鐘，然后在真空下除去溶劑。將1mL 水滴入干燥的肽混合物中，并使其在25 °C 下靜置30分鐘，以1mM 終濃度形成膠囊。隨后，將含有溶液的膠囊在4 °C 溫育1小時(shí)以防止膠囊融合[4]。1小時(shí)后，將肽樣品放回25 °C 30分鐘，然后干燥，進(jìn)行對(duì)數(shù)貯存或與 dsRNA 混合。2.3.DsRNA-BAPC 納米顆粒的制備為了處理10只赤擬谷盜甲蟲，將含有10μg Armet、 BiP 或*的200μL 水溶液分別滴加到含有400μMBAPC 的200μL 水溶液中，或?qū)?span> Armet 和 BiP 一起滴加到200μL 水溶液中。對(duì)于用 BiP-dsRNA 和 Armet-dsRNA 的組合處理的組，我們加入每種5μg 并以400μM 與200μL BAPC 混合。溶液通過移液管小心地混合，并允許在加入 CaCl2之前停留10分鐘，以產(chǎn)生1.0 mM 的最終濃度。培養(yǎng)30分鐘后，將溶液與昆蟲飼料混合。為了處理5種碗豆蚜蚜蟲，將0.1 μg 的 Acyrthosphopisum BiP-dsRNA 溶于10μL 水中。隨后，將該溶液滴加到含有200μM BAPC 的10μL 溶液中。溶液小心地與移液管混合，并允許在加入產(chǎn)生1.0 mM 最終濃度的 CaCl2之前停留10分鐘。在另外10分鐘的疾病潛伏期后，加入蔗糖(500毫米)。對(duì)于用較少量 BiP-dsRNA 處理的昆蟲，如上所述制備的 BAPC/核苷酸復(fù)合物在加入 CaCl2之前用水稀釋10倍和100倍。

2.4.動(dòng)態(tài)光散射(dLS)和 zeta 電位(ZP)如前所述制備了不同的 dsRNA-BAPC 制劑(dsRNA-BAPC 納米顆粒的制備)。所有樣品的粒徑和 zeta 電位均使用 Zetasizer Nano zS (Westborough 馬薩諸塞州莫爾文儀器有限公司)測(cè)定。樣品在 CaCl2(2mM)中分析，所有測(cè)量一式三份進(jìn)行。原子力顯微鏡如前所述制備 dsRNA-BAPC 復(fù)合物并用天然氧化物沉積在硅襯底上。使用來自 ParkSystems (韓國)的 ParkXE7 AFM 以非接觸模式獲得地形圖像，使用標(biāo)稱端直徑為14nm 并標(biāo)稱彈簧常數(shù)為42N/m 的硅懸臂梁(ParkSystems，PPP-NRC)。硅襯底表面有一層薄的天然氧化物(約1-2nm)(未進(jìn)行 HF/BOE 蝕刻)。

2.6.根據(jù) Mutti 等[21]的研究，豌豆蚜(Acyrthosphon pisum)被關(guān)在蠶豆屬(Viciafaba)植物的籠子里。所有的飼養(yǎng)試驗(yàn)生物測(cè)定都在22 °C 下進(jìn)行，并編程為16小時(shí)的光照和8小時(shí)的黑暗周期。以含5% 啤酒糟的面粉為飼料，在30 °C 下飼養(yǎng)赤擬谷盜(GA-1)昆蟲。Avila 等人。控制釋放雜志273(2018)139-146140酵母在標(biāo)準(zhǔn)條件下如前所述[22,23]。通過混合70毫克黃金水牛粉(Heartland Mill，Inc.)制備了含 ds-RNA-BAPC 納米顆粒(赤擬谷盜)培養(yǎng)基的飼料，用于喂養(yǎng)10只昆蟲。如前所述，用400μL dsRNA-BAPC 復(fù)合物制備的 Marienthal，KS)。將面粉與雙鏈 RNA-BAPCs 溶液反轉(zhuǎn)幾次混合。這種混合物在真空下保持大約10小時(shí)。當(dāng)混合物*干燥后，我們將其分配到96孔板中，每孔加入7毫克左右。立即，我們放置一個(gè)昆蟲每孔(幼蟲和/或蛹前階段(質(zhì)量約2毫克)。對(duì)于僅含有 dsRNA 的對(duì)照組，我們將70mg 金牛花粉與溶于400μL 水和160mM CaCl 2中的10μg Armet-，BiP- 或 Vermilion-dsRNA 混合。其他對(duì)照通過將70mg 面粉與400μL 水加減 BAPC (40μM)混合制備。我們分析了每組30-35只動(dòng)物。動(dòng)物被保持在30攝氏度的定時(shí)期與視覺監(jiān)測(cè)的表型和死亡率2.8.對(duì)于對(duì)照樣本，將蚜蟲放置在含有滅菌的2% 瓊脂(補(bǔ)充有0.1% 奇跡生長肥料和0.03% 甲基碗豆蚜)的培養(yǎng)皿中，插入健康的葉子(蠶豆) ，并喂食48小時(shí)[24]。對(duì)于 dsRNA 喂養(yǎng)試驗(yàn)，將多達(dá)5只成年蚜蟲(沒有過度擁擠)用細(xì)漆刷轉(zhuǎn)移到喂養(yǎng)無菌塑料杯(Falcon，Primaria，NJ，USA)上。在含有5只昆蟲杯的塑料杯上放置一層拉伸的石蠟?zāi)?span>(美國費(fèi)舍爾科學(xué)研究所)。將含有游離或 BAPC 綴合的 BiPdsRNA 的人工飼料(20μL)置于在杯上拉伸的膜的頂部。第二層拉伸膜被放置在飲食的頂部，從而形成口袋。蚜蟲通過穿透膜的底層進(jìn)食。采用0.1 μg、0.01 μg 和0.001 μg 含12.5 mM CaCl _ 2的三種不同濃度的 dsRNA。蚜蟲被允許以這種食物為食48小時(shí)。然后將蚜蟲轉(zhuǎn)移到如前所述為對(duì)照組準(zhǔn)備的植物葉片中。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，三個(gè)重復(fù)包括在人工飼料喂養(yǎng)。在每個(gè)飼養(yǎng)試驗(yàn)中，每組10 × 3只蚜蟲分別進(jìn)行存活試驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組每天進(jìn)行監(jiān)測(cè)，記錄并清除死亡的成年蚜蟲和若蟲。2.9.根據(jù)制造商(Invitrogen，CA，USA)提供的提取 RNA 的方案，在1mL TRIZOL 試劑中用聚丙烯杵勻漿成年蚜蟲(10種昆蟲)。按照 tURBO 無 DNA 試劑盒(Ambion，Austin，TX)提供的方案處理 RNA 分?jǐn)?shù)，可將 dsRNA 樣本中的 DNA 污染降至低。使用 SuperScript III FirstStrand 合成系統(tǒng)進(jìn)行 RT-PCR (Invitrogen，CA，USA) ，將 RNA (4μg 無 DNA)反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA (cDNA)。對(duì)赤擬谷盜幼蟲(7種昆蟲)進(jìn)行了類似的處理。兩種昆蟲目標(biāo)基因的核苷酸序列(豌豆蚜: p-BiP: NCBI 登錄號(hào)。從 NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得 XM _ 003244000.1) ; 赤錐菌: TcBiP: XM _ 015982882.1; TcArmet: XM _ 966545.3; TcVer: NM _ 001039410)。使用 AmpliScribeTM T7 Flash TranscriptionKit 方案(Cat。沒有。美國震中生物技術(shù)公司 ASF3507)。PCR 產(chǎn)物在40mM 三醋酸鹽(pH8.3)和1mM EDTA 中制備的1.4% 瓊脂糖凝膠上分離。溴化乙錠加入至0.7 μg/mL 的最終濃度，然后讓瓊脂糖凝固。在紫外光下拍攝凝膠并通過凝膠文檔(UVP-Digital Image System，Upland，CA，USA)捕獲圖像。2.11.在未修飾的 Armet-dsRNA 的5′端引入了 Armet-dsRNA 巰基的熒光標(biāo)記。使用5’0EndTAg 核酸標(biāo)記試劑盒(Vector Laboratories，USA)摻入巰基官能團(tuán)。隨后，我們納入了巰基反應(yīng)性熒光標(biāo)記 Atto633-Maleimide (Atto-Tec GmbH，Germany)。簡而言之，將0.4 nmol 的 Armet-dsRNA 在37 °C 溫育30分鐘。與 ATPγ S 和 T4多核苷酸激酶(T4-PNK)。T4-PNK 將硫代磷酸從 ATPγ 轉(zhuǎn)移到雙鏈核酸的5′羥基上。接下來，將 Atto633-馬來酰亞胺染料加入過量的3M 中，并在室溫下孵育3小時(shí)，保持 pH = 8以確保巰基的去質(zhì)子化。在這個(gè)疾病潛伏期之后，用緩沖分離 dsRNA。在純化完成后，使用納米滴方法讀取濃度，并通過熒光測(cè)量確認(rèn)標(biāo)記。對(duì)于飲食制劑，熒光標(biāo)記的 Armet-dsRNA 按照前面描述的方案與 BAPC 混合。接下來，將400μL (10μg)標(biāo)記的 Armet-dsRNA (游離的或與 BAPC 復(fù)合的)與100mg 面粉混合。這些混合物在真空下保持大約10小時(shí)。當(dāng)兩種混合物*干燥后，它們被分配到一個(gè)96孔的平板中，每孔加入10毫克以治療赤擬谷盜10的幼蟲。為了比較的目的，另外一個(gè)控制組包含只有水的飲食。

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