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    Cellutron穩(wěn)定的細(xì)胞系開發(fā)

    發(fā)布時(shí)間: 2022-08-29  點(diǎn)擊次數(shù): 1232次

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    穩(wěn)定的細(xì)胞系開發(fā)

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    穩(wěn)定細(xì)胞系-G      穩(wěn)定細(xì)胞系-R

     在熒光報(bào)告基因的初始轉(zhuǎn)導(dǎo)兩個(gè)月后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的小鼠胚胎干細(xì)胞表達(dá) GFP RFP

    親代細(xì)胞系:人和小鼠胚胎干細(xì)胞和 iPSHEK293CHOBHKNS0 細(xì)胞、H9C2 或細(xì)胞系。

    穩(wěn)定細(xì)胞系產(chǎn)生的過程和時(shí)間線:

    1. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的基因合成與構(gòu)建           

    進(jìn)行優(yōu)化的基因合成并將基因克隆到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中(1 周)

    2. 轉(zhuǎn)基因表達(dá)分析      

    用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染親本細(xì)胞系并通過 RT-PCR/Western blot/ELISA 評估轉(zhuǎn)基因的表達(dá)(1 周)

    3. 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子

    對*級克隆進(jìn)行穩(wěn)定性篩選并評估最終細(xì)胞系的 10 次傳代。(約 4 周)

    向客戶提供 2 瓶*級穩(wěn)定克隆

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    肌節(jié) α 肌動(dòng)蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)染色

     

    心肌細(xì)胞在 60 mm 板中培養(yǎng)

    1X PBS 沖洗細(xì)胞,在室溫下用 PBS 中的 3.7% 甲醛固定細(xì)胞 10 分鐘,然后在 70% ETOH 5 分鐘,用 PBS 中的 0.2% Triton-X 100 孵育 5 分鐘,然后用 1X PBS 洗滌細(xì)胞兩次5分鐘。

    1ml 2% BSA PBS 孵育細(xì)胞 30 分鐘。在板中加入針對肌節(jié) α 肌動(dòng)蛋白 (Sigma, Cat#: A2172) 的原代小鼠抗體 1 小時(shí),室溫,O/N4°C

    1X PBS 清洗細(xì)胞 3 次,每次 10 分鐘。

    HRP 偶聯(lián)的二抗在室溫下針對小鼠孵育 1 小時(shí)

    1X PBS 清洗細(xì)胞 3 次,每次 10 分鐘。

    1 ml DAB 溶液孵育 10 分鐘。用 1X PBS 清洗。

    *在您需要之前準(zhǔn)備新鮮的 DABSigmaCat#D8001)溶液:

    * 37 C 下解凍 DAB 原液,直到不再渾濁。將 5ul DAB 原液添加到 1ml 1X PBS 中。加入 1ul 30% H2O2 并充分混合。

    在顯微鏡下檢查染色的細(xì)胞。

    成人心肌細(xì)胞分離

    成年大鼠/

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